GENOFORGE

Εισαγωγή & αναγνώριση αρχείων

Αυτόματη ανίχνευση μορφής αρχείου εισόδου: VCF v4.x, ANNOVAR table, ClinVar TSV, PLINK map/ped, DTC (23andMe/AncestryDNA), FASTA αλληλουχίας αναφοράς, BED/GTF εξωνίων, GEO series matrix, RNA-seq count matrices (DESeq2/edgeR format).

Γονιδίωμα αναφοράς

Φόρτωση FASTA αλληλουχίας αναφοράς με ευρετήριο .fai (samtools faidx format) για επαλήθευση αλληλομόρφων και υπολογισμό τρινουκλεοτιδικού πλαισίου. Απαιτείται για ανάλυση μεταλλαξιγενετικών υπογραφών.

Ποιοτικός έλεγχος (QC)

Υπολογισμός δεικτών τεχνικής ποιότητας αλληλούχισης: κατανομή βάθους κάλυψης (DP) ανά θέση, κατανομή ποιότητας κλήσεων (QUAL / GQ), αναλογία Ti/Tv (εξωνικό εύρος: 2,0–3,5 SNV), ποσοστό PASS calls, πυκνότητα παραλλαγών ανά χρωμόσωμα και λόγος ετερόζυγων/ομόζυγων. Η αναλογία Ti/Tv εκτός φυσιολογικού εύρους (2,0–3,5 για WES, 1,8–2,1 για WGS) αποτελεί ένδειξη συστηματικού τεχνικού σφάλματος.

Μηχανή φιλτραρίσματος

Διαδοχική εφαρμογή κριτηρίων φιλτραρίσματος με πλήρη καταγραφή («χοάνη»):

• DP ≥ N× — ελάχιστο βάθος κάλυψης (default: 10)
• QUAL ≥ N — ελάχιστη ποιότητα κλήσης (default: 30)
• VAF ≥ N — ελάχιστος λόγος αλληλομόρφων (default: 0,20)
• MAF ≤ N — μέγιστη συχνότητα στον πληθυσμό (default: 1%)
• SpliceDist ≥ N bp — ελάχιστη απόσταση από θέση ματίσματος
• Impact — HIGH, MODERATE, LOW, MODIFIER (VEP/ACMG classification)

Πίνακας παραλλαγών

Ταξινομήσιμος πίνακας παραλλαγών που πέρασαν τα κριτήρια φιλτραρίσματος, με πεδία: χρωμοσωμική θέση (CHROM:POS), REF/ALT αλληλόμορφα, HGVS.c / HGVS.p notation, rsID (dbSNP), γονίδιο, επίπτωση (VEP consequence), ClinVar clinical significance, MAF (gnomAD), DP, QUAL, VAF, ζυγωτικότητα (HOM/HET), βαθμός προτεραιότητας. Εξαγωγή σε CSV.

Βαθμολόγηση & ενδείξεις

Αλγόριθμος ιεράρχησης εμπνευσμένος από τα κριτήρια ACMG/AMP (Richards et al., 2015, Genet Med). Παράγοντες βαρύτητας:

• Επίπτωση VEP: HIGH=30p (stop gained, frameshift, splice acceptor/donor), MODERATE=18p (missense, in-frame indel), LOW=6p
• Σπανιότητα: MAF<0,01%=22p, <0,1%=14p, <1%=8p
• Εγγύτητα σε θέση ματίσματος: ±2bp=16p (κλασικό splice), ±8bp=8p (εκτεταμένο)
• Τεχνική αξιοπιστία: DP+QUAL+VAF composite score
• ClinVar P/LP: +30p πριμ
• Σήμα έκφρασης: |log2FC|>1, FDR<0,05 — +8p

Γονίδια & φορτίο παραλλαγών

Συγκέντρωση παραλλαγών ανά γονίδιο: συνολικός αριθμός, μέγιστος βαθμός, αριθμός HIGH/MODERATE impact. Ιεράρχηση γονιδίων με βάση συνολικό φορτίο — χρήσιμο για ανίχνευση γονιδίων με υψηλό mutational burden που μπορεί να υποδηλώνει απώλεια λειτουργίας (loss-of-function). Εμφανίζει επίσης γονίδια της λίστας ACMG Secondary Findings v3.2 (73 γονίδια).

Πρότυπα κληρονόμησης

Ανάλυση τριάδας (proband + γονέας 1 + γονέας 2) για εκτίμηση προτύπου κληρονόμησης: de novo (παρούσα μόνο στο proband), αυτοσωμικό επικρατές (AD), αυτοσωμικό υπολειπόμενο (AR) / σύνθετο ετερόζυγο (compound heterozygous), Χ-συνδεόμενο (ημιζύγωτο σε άρρεν). Απαιτεί VCF με πεδία γονοτύπων και δήλωση φύλου.

Εξώνια & εσώνια

Φόρτωση GTF/BED εξωνίων για ανάλυση τοπολογίας θέσεων παραλλαγών σε σχέση με δομή μεταγράφου: εξωνική, ιντρονική, UTR 5'/3', περι-σπλαϊσική (splice acceptor/donor ±2bp, branch point region). Υπολογισμός απόστασης κάθε παραλλαγής από την πλησιέστερη θέση ματίσματος.

Θέσεις ματίσματος

Εξειδικευμένη ανάλυση παραλλαγών σε θέσεις ματίσματος: κλασικές ±1,+2 (invariant GT-AG), εκτεταμένες ±3 έως ±8, και ιντρονικές παραλλαγές που μπορεί να επηρεάζουν cryptic splice sites. Εμφανίζει δυνητικά σενάρια exon skipping, intron retention και altered splice site usage.

Προβολή αλληλουχίας

Εξαγωγή και απεικόνιση γονιδιακής αλληλουχίας αναφοράς (από φορτωμένο FASTA) στην περιοχή κάθε επιλεγμένης παραλλαγής. Εμφανίζει τόσο τη WT αλληλουχία όσο και τη μεταλλαγμένη, με επισήμανση του κωδικονίου και in-silico μετάφραση για coding variants.

Διαφορική έκφραση

Ανάλυση διαφορικής έκφρασης από πίνακες μετρήσεων (counts matrix): ομαλοποίηση TMM/DESeq2-style, παρεμβολή διασποράς, έλεγχος Welch t-test με FDR διόρθωση Benjamini-Hochberg. Κατώφλια: |log2FC| > 1,0, FDR < 0,05. Απεικόνιση volcano plot (−log₁₀ FDR vs log₂FC) και heatmap.

Ηφαίστειο & θερμοχάρτης

Διαδραστικές απεικονίσεις αποτελεσμάτων διαφορικής έκφρασης: volcano plot με επισήμανση σημαντικά διαφοροποιημένων γονιδίων (κόκκινο: FDR<0,05 & |log2FC|>1), θερμοχάρτης κανονικοποιημένης έκφρασης των top-N DEGs με ιεραρχική ομαδοποίηση δειγμάτων (Euclidean distance, Ward linkage).

PCA δειγμάτων

Ανάλυση κύριων συνιστωσών (Principal Component Analysis) κανονικοποιημένης έκφρασης για εκτίμηση ομοιότητας δειγμάτων και ανίχνευση batch effects, outliers ή επιμόλυνσης. Εμφανίζει PC1/PC2 με ποσοστό επεξηγούμενης διασποράς και βελτιστοποίηση με SVD.

Εμπλουτισμός γονιδιακού συνόλου (GSEA)

Ανάλυση Gene Set Enrichment για τοπολογικό εμπλουτισμό υπέρ-εκφρασμένων γονιδίων σε βιολογικές οδούς. Εφαρμόζει hypergeometric test με BH FDR διόρθωση έναντι εσωτερικής βάσης γονιδιακών συνόλων. Εντοπίζει σημαντικά ενεργοποιημένες ή καταστολοποιημένες βιολογικές διεργασίες.

Μεταλλαξιγενετικές υπογραφές (COSMIC SBS)

Ανάλυση προφίλ 96 κατηγοριών βάσει τρινουκλεοτιδικού πλαισίου και αντιπαράθεση με 67 γνωστές υπογραφές COSMIC SBS v3.2 (Alexandrov et al., 2020, Nature) με στοχαστική ελαχιστοποίηση (cosine similarity). Αναγνωρίζει αιτιολογικές διεργασίες μεταλλαξιγένεσης: SBS1 (γήρανση/5mC), SBS4 (κάπνισμα), SBS7 (UV), SBS11 (αλκυλιωτικοί παράγοντες χημειοθεραπείας), SBS17 (5-FU), SBS22 (αριστολοχικά οξέα). Απαιτεί φορτωμένο γονιδίωμα αναφοράς και ≥50 SNVs για στατιστική αξιοπιστία.

Σύγκλιση ανεξάρτητων αποδεικτικών αξόνων

Εντοπισμός γονιδίων με σύγκλιση πολλαπλών ανεξάρτητων τύπων αποδείξεων:

• Παραλλαγή HIGH/MODERATE impact (variant evidence)
• Σημαντική διαφορική έκφραση |log2FC|>1, FDR<0,05 (expression evidence)
• Γονίδιο ACMG Secondary Findings v3.2 (literature evidence)
• Εγγραφή ClinVar Pathogenic/Likely pathogenic (clinical evidence)

Γονίδιο με ≥2 ανεξάρτητους άξονες ιεραρχείται υψηλότερα ανεξάρτητα από τον βαθμό κάθε μεμονωμένης ένδειξης — αρχή σύγκλισης αποδεικτικών στοιχείων (convergent evidence).

Αναφορά & εξαγωγή

Παραγωγή πολυσέλιδης αναφοράς PDF (via html2canvas) με δομή: (1) εξώφυλλο με μεταδεδομένα αναφοράς, (2) εκτενής σύνοψη ευρημάτων, (3) δείκτες QC με γραφήματα, (4) χοάνη φιλτραρίσματος, (5) κατανομή impact, (6) γράφημα κορυφαίων γονιδίων, (7) ανά-παραλλαγή κάρτες με πλήρες annotation (80 κορυφαίες), (8) σύγκλιση ενδείξεων, (9) γλωσσάριο βιοπληροφορικής ορολογίας, (10) μεθοδολογία & όρια. Εξαγωγή επίσης σε JSON (πλήρες) και CSV (παραλλαγές).

Μεθοδολογία & όρια

Ενότητα τεκμηρίωσης με: ακριβείς παραμέτρους ανάλυσης που χρησιμοποιήθηκαν, εκδόσεις βάσεων δεδομένων (Ensembl release, ClinVar build date), συνδρομητικές βιβλιογραφικές αναφορές, ρητά όρια της ανάλυσης (π.χ. απουσία copy number variation analysis, SV, mitochondrial variants), και δήλωση ότι τα αποτελέσματα δεν αποτελούν κλινική ταξινόμηση κατά ACMG/AMP.